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蛋白質(zhì)的定量測定實(shí)驗(yàn)

[2015/1/16]

  蛋白質(zhì)定量是生物化學(xué)、食品檢驗(yàn)和其它生命學(xué)科最常涉及的分析內(nèi)容,是臨床診斷的重要指標(biāo),也是許多生物制品、藥物、食品質(zhì)量檢測的重要指標(biāo)。生化實(shí)驗(yàn)中,在對生化藥品,特別是蛋白質(zhì)、酶、某些多肽或蛋白質(zhì)激素的分離純化時(shí),對蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析是非常重要的。

  然而蛋白質(zhì)的種類很多,結(jié)構(gòu)不均一,分子量又相差很大,功能各異,這給建立一個(gè)理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法帶來了很大的困難。目前測定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種,不同的方法各有其特點(diǎn)。

  紫外分光光度法是根據(jù)蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)來對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量的;而凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法、BCA法、膠體金法測試根據(jù)蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)來實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量的;根據(jù)蛋白質(zhì)的染色性質(zhì)的不同,又建立了考馬氏亮藍(lán)染色法和銀染法;此外還有人在這些蛋白質(zhì)定量方法的基礎(chǔ)上建立了熒光法。

  由于每種方法都有其自身的特點(diǎn)和局限性,因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根據(jù)不同情況選用恰當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)測定方法,以滿足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果最精確,但操作復(fù)雜,用于大批量樣品的測試則不太合格;雙縮脲法操作簡單,線性關(guān)系好,但靈敏度差,樣品需要量大,測量范圍窄,因此在科研上的應(yīng)用受到限制;而酚試劑法彌補(bǔ)了它的缺點(diǎn),它結(jié)合了雙縮脲法中銅鹽反應(yīng)與Folin-ciocalteau試劑反應(yīng)的特點(diǎn),因而在科研中被廣泛采用,但是它的干擾因素較多;考馬氏亮蘭染色法因其靈敏而簡便開始重新受到關(guān)注;BCA法以其試劑穩(wěn)定,抗干擾能力較強(qiáng),結(jié)果穩(wěn)定,靈敏度高而受到歡迎;而膠體金法具有較高的靈敏度,可達(dá)到毫微克水平,用于微量蛋白的測定。
附:常用的測定蛋白質(zhì)含量方法的比較

方   法
測定范圍
(μg/ml)
不同種類
蛋白的差異
最大吸收
波長(nm)
特                 點(diǎn)
凱氏定氮法
 
 
標(biāo)準(zhǔn)方法,準(zhǔn)確,操作麻煩,費(fèi)時(shí),靈敏度低,適用于標(biāo)準(zhǔn)的測定
紫外分光光度法
100—1000
280
205
靈敏,快速,不消耗樣品,核酸類物質(zhì)有影響
 
 
雙縮脲法
1000—10000
540
重復(fù)性、線性關(guān)系好,靈敏度低,測定范圍窄,樣品需要量大
Folin-酚試劑法
20—500
750
靈敏,費(fèi)時(shí)較長,干擾物質(zhì)多
考馬氏亮藍(lán)G-250
50—500
595
靈敏度高,穩(wěn)定,誤差較大,顏色會(huì)轉(zhuǎn)移
BCA
50—500
562
靈敏度高,穩(wěn)定,干擾因素少,費(fèi)時(shí)較長

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