盡管固定對于組織形態(tài)的保留是必不可少的，但這一過程對IHC/ICC檢測也有不良影響。固定可能會改變蛋白的生化特性，如目的表位被掩蓋，或不再與一抗結(jié)合。表位的掩蓋可能是由氨基酸與表位的交聯(lián)、表位附近無關(guān)肽段的交聯(lián)、表位構(gòu)象的改變或抗原靜電荷的改變引起的。抗原修復(fù)指的是逆轉(zhuǎn)表位掩蓋和恢復(fù)表位-抗體結(jié)合的技術(shù)。

　　抗原修復(fù)技術(shù)

　　抗原修復(fù)的需要取決于多個變量，包括但不限于，目的抗原、所使用的抗體、組織類型，以及固定方法和持續(xù)時間。多克隆抗體能識別多個表位，因此即使不進(jìn)行抗原修復(fù)，它們也比單克隆抗體更有可能檢測到特定抗原。

　　目前有多種技術(shù)可恢復(fù)表位的免疫反應(yīng)性。簡單的方法有改變抗體稀釋液的pH或陽離子濃度，這可能影響抗體與表位的親和力。對于部分掩蓋的表位，在開始抗原修復(fù)之前可以先試試改變一抗的孵育條件。不過，這一步也需要抗體濃度、孵育時間和溫度的進(jìn)一步優(yōu)化。在討論抗體修復(fù)方法時，技術(shù)通常分為兩大類，蛋白酶誘導(dǎo)的表位修復(fù)(PIER)和熱誘導(dǎo)的表位修復(fù)(HIER)。一旦優(yōu)化好，抗原修復(fù)的影響可能是明顯的。

　　蛋白酶誘導(dǎo)的表位修復(fù)(PIER)

　　在PIER方法中，蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶等都曾成功恢復(fù)抗體與表位的結(jié)合。人們認(rèn)為作用機制是切割了可能遮蓋表位的肽段。PIER的缺點在于恢復(fù)免疫反應(yīng)性的成功率低，且有可能破壞組織形態(tài)和目的抗原。

　　熱誘導(dǎo)的表位修復(fù)(HIER)

　　HIER被認(rèn)為能逆轉(zhuǎn)一些交聯(lián)，并實現(xiàn)表位二級或三級結(jié)構(gòu)的重建。每種組織、固定方法和待研究抗原的實驗方案必須經(jīng)過優(yōu)化�？偟膩碚f，HIER的成功率比PIER要高得多。HIER可利用微波爐、高壓鍋、蒸屜、高壓滅菌鍋或水浴開展。在HIER實驗中，微波爐是越來越流行的設(shè)備。這些方案大多加熱5分鐘，然后更換緩沖液。對于所有HIER方法，在開始IHC/ICC孵育之前必須讓玻片冷卻。HIER對時間、溫度、緩沖液和pH特別敏感，最佳方法必須根據(jù)經(jīng)驗確定。

　　優(yōu)化與限制

　　抗原修復(fù)可能需要加強樣品與玻片或蓋玻片的附著。此外，此技術(shù)對于冰凍組織切片和酒精固定切片通常過于劇烈。對于每種設(shè)備，時間、溫度和pH必須經(jīng)過優(yōu)化(如92-95 °C水浴中的5-10分鐘，相對120 °C高壓鍋中的1-5分鐘)。為了優(yōu)化抗原修復(fù)，必須開展初步研究，使用時間、溫度和pH的各種組合。在使用抗原修復(fù)方法時，應(yīng)始終考慮到染色假象的可能性。實驗應(yīng)當(dāng)包含對照，以證明特異的抗體結(jié)合，因為染色常受到實驗中多個變量的影響。