TNF包括TNFα與TNFß兩型，它們具有極其相似的生物學(xué)活性，在體內(nèi)外可對(duì)一些腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系起殺傷作用，而對(duì)正常細(xì)胞則無細(xì)胞毒效應(yīng)。根據(jù)這一特點(diǎn)，可利用TNF對(duì)敏感靶細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)，在體外檢測(cè)TNF的活性水平，既可檢測(cè)分泌型TNF(sTNF)，也可檢測(cè)膜結(jié)合型TNF(mTNF)。最常用的方法是體外檢測(cè)TNF對(duì)小鼠成纖維瘤細(xì)胞(L929細(xì)胞)的細(xì)胞毒效應(yīng)。

　　【基本原理】

　　TNF對(duì)L929細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，如同時(shí)加用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D，則可提高L929細(xì)胞對(duì)TNF的敏感性10～100倍。利用染料結(jié)晶紫或MTT可使活細(xì)胞染色，再用脫色液將染料脫出，測(cè)定其OD值，即可反應(yīng)細(xì)胞的存活狀態(tài)或TNF對(duì)L929細(xì)胞的殺傷率，通過計(jì)算細(xì)胞死亡率，并與sTNF標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，即可檢測(cè)待測(cè)樣品sTNF活性單位。

　　【材料和試劑】

　　(1)L929細(xì)胞株(存活率應(yīng)>95%)

　　(2)TNF標(biāo)準(zhǔn)品：作倍比稀釋(100U/ml～0.1U/ml)。

　　(3)待測(cè)樣品：作倍比稀釋至少6個(gè)不同稀釋度。

　　(4)0.25%胰蛋白酶

　　(5)RPMI-1640培養(yǎng)液及PBS

　　(6)0.25%結(jié)晶紫(溶于20%甲醇中)，或者5mg/mlMTT(溶于PBS中)

　　(7)放線菌素D(分存液濃度為100ug/ml)

　　(8)檸檬酸鈉緩沖液(0.9%檸檬酸鈉，0.02mol/L鹽酸，47.5%乙醇，為脫色液);酸化異丙醇(0.04mol/LHCL異丙醇)

　　(9)96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，刻度吸管，毛細(xì)吸管，加樣器(頭)，刻度離心管，離心機(jī)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板，倒置顯微鏡，超凈工作臺(tái)，CO2培養(yǎng)箱。

　　(10)酶標(biāo)測(cè)定儀，570nm濾光片，630nm濾光片。

　　【操作步驟】

　　(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化2-3min，然后洗滌細(xì)胞2次，以去除消化液及原生長(zhǎng)培養(yǎng)液;

　　(2)用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)L929細(xì)胞濃度為2×105/ml;

　　(3)將上述細(xì)胞懸液加至96孔培養(yǎng)板，100ul/孔;

　　(4)置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;

　　(5)吸去細(xì)胞培養(yǎng)上清液后，各孔分別加入倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品，100ul/孔，各設(shè)雙復(fù)孔，并設(shè)培養(yǎng)液陰性對(duì)照及空白對(duì)照(即L929細(xì)胞、標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品均不加入，僅加培養(yǎng)液);

　　(6)同時(shí)向各孔均加入10ul放線菌素D(0.5～1μg/孔);

　　(7)置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14h;

　　(8)甩棄上清，并用RPMI-1640培養(yǎng)液洗細(xì)胞1次;

　　(9)每孔均加入0.25%結(jié)晶紫，100μl/孔，室溫下染色10min;

　　(10)甩棄上清，再用PBS洗板3次;

　　(11)室溫下涼干，加入檸檬酸鈉緩沖液脫色，100μl/孔;

　　(12)充分混勻后，用酶標(biāo)儀以檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm測(cè)各孔OD值。